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冷凍保存細(xì)胞之方法：

人細(xì)胞 冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 ℃不可超過(guò)1 小時(shí)， 以防止冰晶過(guò)大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

細(xì)胞凍存步驟：

資源名稱 人細(xì)胞

種屬 MCF7

類型 貼壁生長(zhǎng)

形態(tài) CM1-1培養(yǎng)液中，貼壁，上皮細(xì)胞樣，多角形，緊密排列

分離基物 該細(xì)胞是從一名69歲的白人患者的中分離建立的。

提供形式 凍存管/T25培養(yǎng)瓶

安全等級(jí) 2

模式菌株 未知

培養(yǎng)方法

傳代方法 將舊培養(yǎng)液吸除，PBS清洗兩遍后，加入6mL（/100mm皿）胰酶，在顯微鏡下觀察，期間禁止搖晃培養(yǎng)皿，細(xì)胞剛有脫落時(shí)，則吸除大部分胰酶，留約0.5mL，移至培養(yǎng)箱消化，約3min取出。傳代用12mL CM1-1培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打均勻細(xì)胞，后可分3~6皿培養(yǎng)；

生長(zhǎng)條件 37℃，5%CO2，CM1-1培養(yǎng)液。CM1-1培養(yǎng)液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高糖培養(yǎng)液，含谷氨酰胺，含丙酮酸鈉。

生長(zhǎng)特性 細(xì)胞剛復(fù)蘇時(shí)細(xì)胞狀態(tài)不好，傳代一次后細(xì)胞狀態(tài)就可以恢復(fù)。

存儲(chǔ)條件 凍存則用6mL凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化，吹打均勻，分為6支凍存管，用程序降溫盒于-80℃凍存，過(guò)夜移至液氮中保存。

細(xì)胞分類：

第一種：

是凍存產(chǎn)品，由氮直液接拿出，干冰運(yùn)輸給客戶。一般不推薦這種，也較少使用這種方式，因?yàn)閺?fù)蘇手法對(duì)于細(xì)胞狀態(tài)影響較大，一旦細(xì)胞狀態(tài)不好，很難說(shuō)是細(xì)胞自身不行，還是復(fù)蘇沒(méi)操作好；另外溫度對(duì)細(xì)胞、基因功能狀態(tài)影響很大，也不是細(xì)胞儲(chǔ)存的zui好方式，快遞時(shí)間也很難控制，多種因素影響產(chǎn)品的質(zhì)量；干冰運(yùn)輸需要額外添加400元的運(yùn)費(fèi)(順豐)。

第二種：

是我們復(fù)蘇好細(xì)胞，QC通過(guò)后，T-25灌滿培養(yǎng)基常溫運(yùn)輸給客戶，排除復(fù)蘇造成影響，常溫運(yùn)輸也對(duì)細(xì)胞影響也不大，只需加25元運(yùn)費(fèi)(順豐)。

質(zhì)量保證：我們的細(xì)胞株來(lái)源于ATCC、ECACC、DSMZ、JCRB等，購(gòu)買(mǎi)到貨后，由我們實(shí)驗(yàn)室擴(kuò)增、凍存，凍存的產(chǎn)品全部經(jīng)過(guò)QC檢測(cè)，100%進(jìn)口來(lái)源，100%保證5代以內(nèi)，活力>95%，無(wú)細(xì)菌、真菌、支原體污染。

細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程：

細(xì)胞培養(yǎng)步驟：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備MEM培養(yǎng)基(MEM:GIBCO,貨號(hào)11095-080)，85%；北美胎牛血清(United States，GIBCO，貨號(hào)16000-044)，15%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37攝氏度，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%完全培養(yǎng)基，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配。液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入4mL培養(yǎng)基混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)⒓?xì)胞懸液加入10cm皿中，加入約8ml培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對(duì)于貼壁細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

1.棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤(rùn)洗細(xì)胞1-2次。

2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消化。

3.按6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。

4.將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。貼壁細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后加入少量胰酶，細(xì)胞變圓脫落后，加入約1ml含血清的培養(yǎng)基后加入凍存管中，再添加10%DMSO后進(jìn)行凍存。

以下是人細(xì)胞 的相關(guān)熱銷產(chǎn)品：

Bacillus licheniformis地衣形芽孢桿菌LAMP試劑盒

Bacillus spp.芽孢桿菌通用LAMP試劑盒

Bacillus subtilis枯草芽孢桿菌LAMP試劑盒

Bacteroides fragilis脆弱擬桿菌LAMP試劑盒

Bacteroides spp.擬桿菌屬通用LAMP試劑盒

Baculoviral Midgut Gland Necrosis Type Virus (BMNV)中腸腺壞死桿狀病毒LAMP試劑盒

Baculovirus Penaei(BP)對(duì)蝦桿狀病毒LAMP試劑盒

Balamuthia mandrillaris巴氏LAMP試劑盒

Barmah Forest Virus(BFV) 巴馬森林病毒RT-LAMP試劑盒

Bartonella bacilliformis桿狀巴爾通體LAMP試劑盒

Bartonella elizabethae伊麗莎白巴爾通體LAMP試劑盒

Bartonella henselae漢氏巴爾通體（漢塞巴爾通體、貓抓病、貓抓熱）LAMP試劑盒

Bartonella quintana五日熱巴爾通體LAMP試劑盒

Bartonella spp.巴爾通體通用LAMP試劑盒

Bartonella vinsonii文氏巴爾通體LAMP試劑盒

Batrachochytrium dendrobatidis箭毒蛙壺菌LAMP試劑盒

Beak and Feather Disease Virus（BFDV）鸚鵡喙羽病病毒LAMP試劑盒

Bear Canyon virus(BCNV)熊峽谷病毒RT-LAMP試劑盒

Beauveria bassiana球孢白僵菌LAMP試劑盒

Bebaru Virus(BEBV)貝巴魯病毒RT-LAMP試劑盒

Besnoitia besnoiti貝氏貝諾孢子蟲(chóng)LAMP試劑盒

Bibersteinia trehalosi海藻百伯史坦菌LAMP試劑盒

Bifidobacterium bifidum兩岐雙岐桿菌LAMP試劑盒

Bifidobacterium longum長(zhǎng)雙歧桿菌LAMP試劑盒

Bifidobacterium spp.雙歧桿菌屬通用LAMP試劑盒

BK病毒(BK Virus、BKV)LAMP試劑盒

Blastocystis spp.芽囊原蟲(chóng)通用LAMP試劑盒

Blastomyces dermatitidis芽生菌LAMP試劑盒

KLK13 / Kallikrein 13 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

EphB6 / EphB6 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

KLK13 / Kallikrein-13 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

EphB6 / EphB6 抗體, 鼠單抗 ELISA    50 μg

BCL2 / Bcl-2 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 μL

BCL2 / Bcl-2 抗體, 鼠單抗 WB   IP    50 μg

KLK13 / Kallikrein 13 抗體, 鼠單抗 ELISA    50 μg

OX-40L / TNFSF4 / CD252 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 IHC-P    50 μg

JAM-A / F11R 抗體 (FITC), 鼠單抗 FCM    25 Test

JAM-A / F11R 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

JAM-A / F11R 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA   WB   IP  50 μg

JAM-A / F11R 抗體 (APC), 鼠單抗 FCM    25 Test

JAM-A / F11R 抗體 (PE), 鼠單抗 FCM    25 Test

JAM-A / F11R 抗體, 鼠單抗 ELISA    50 μg

JAM-A / F11R 抗體, 鼠單抗 FCM   IF   ICC/IF  50 μg

Calnexin / CANX 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 WB    50 μg

#NAME? ELISA    50 μL

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體 (PE), 鼠單抗 FCM   IF   ICC/IF  25 Test

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 鼠單抗 FCM    50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 鼠單抗 50 μL

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體 (APC), 鼠單抗 FCM    25 Test

Dkk3 / REIC 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 ELISA    50 μg

人細(xì)胞 Dkk3 / REIC 抗體, 兔多抗 ELISA    400 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔單抗 ELISA    50 μg

E-Cadherin / CDH1 / E-cad / CD324 抗體, 兔單抗 IHC-P    50 μg

Nos3 / eNOS 抗體, 兔多抗, 抗原親和純化 WB    50 μg

Dkk3 / REIC 抗體, 鼠單抗 ELISA    50 μg

收到人細(xì)胞 *處理？

1、首先，觀察細(xì)胞培養(yǎng)瓶是否完好，培養(yǎng)液是否有漏液、渾濁等現(xiàn)象。若有，請(qǐng)拍照，并及時(shí)與技術(shù)支持聯(lián)系（所拍照片將作為后續(xù)服務(wù)依據(jù)）。

2、用75%酒精擦拭細(xì)胞培養(yǎng)瓶表面，顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)。因運(yùn)輸問(wèn)題，部分貼壁細(xì)胞會(huì)有少量從瓶壁脫落；先不要打開(kāi)培養(yǎng)瓶蓋，將細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2-4小時(shí)，以便穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

3、仔細(xì)閱讀細(xì)胞說(shuō)明書(shū)，了解細(xì)胞相關(guān)信息，如貼壁特性（貼壁/懸?。⒓?xì)胞形態(tài)、所用基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清比例、所需細(xì)胞因子、傳代比例、換液頻率等。

4、靜置完成后，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，鏡檢、拍照，記錄細(xì)胞狀態(tài)（所拍照片將作為后續(xù)服務(wù)依據(jù)）；建議細(xì)胞傳代培養(yǎng)后，定期拍照、記錄細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

5、貼壁細(xì)胞：若細(xì)胞生長(zhǎng)密度超過(guò)80%，可正常傳代；若未超過(guò)80%，移除細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基，預(yù)留5ml左右繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)80%左右再進(jìn)行傳代操作，瓶蓋可稍微擰松。

6、懸浮細(xì)胞：將細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至50ml無(wú)菌離心管內(nèi)，1200rpm離心5min，離心后上清培養(yǎng)基可收集備用，管底細(xì)胞沉淀加入5ml培養(yǎng)基吹打、重懸。鏡檢時(shí)，若細(xì)胞密度超過(guò)80%，可將細(xì)胞懸液分至2個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)，補(bǔ)加培養(yǎng)基至5ml；若細(xì)胞密度未超過(guò)80%，將細(xì)胞懸液移至原瓶繼續(xù)培養(yǎng)，直至細(xì)胞密度達(dá)80%左右時(shí)再進(jìn)行傳代操作。